Egzosomy pozyskane z krwi zyskują coraz większą uwagę na rynku medycyny estetycznej. Pomimo ich potencjalnych korzyści, wokół tego tematu krąży wiele mitów i kontrowersji. W tym wpisie przyjrzymy się faktom dotyczącym bezpieczeństwa, procedur izolacji oraz złożoności procesu pozyskiwania w pełni wyizolowanych egzosomów z krwi.
Bezpieczeństwo
Wszystkie badania dotyczące egzosomów autologicznych, które zostały do tej pory opublikowane, były przeprowadzone in vitro, a nieliczne badania in vivo obejmowały jedynie grupę badanych składającą się od 2 do 4 osób po bardzo rygorystycznym screeningu ochotników. Jeśli dawca jest chory, egzosomy mogą zawierać nieprawidłowy kod miRNA, co po ich koncentracji może pogorszyć stan zdrowia biorcy. Fakt ten sprawia, że kwestia egzosomów autologicznych bez dokładnego screeningu pacjenta jest mocno kontrowersyjna w zakresie samego bezpieczeństwa stosowania. Krew jako źródło egzosomów wymaga jeszcze wielu badań ale do tej pory jeszcze nikomu na świecie nie udało się uzyskać w pełni oczyszczonych egzosomów krwi pełnej ani osocza.*
Wytłumaczył to profesor JAN LOTVALL odkrywca egzosomów, laureat LIPID PRIZE, założyciel ISEV, czołowy naukowiec na świecie w zakresie egzosomów w swoim wywiadzie w czasie międzynarodowej konferencji RAES oraz XXIV Międzynarodowego Kongresu Dermatologii Estetycznej i Medycyny Anti-Aging w Warszawie.
Procedura izolacji egzosomów
Izolacja egzosomów jest niezwykle skomplikowana i wymaga użycia sprzętów dostępnych tylko dla laboratoriów badawczych wysokiej klasy np. wysokowydajnych ultrawirówek, które kosztują od 500 000 zł do nawet do 1 mln zł. Proces obejmuje wielogodzinne wirowanie sekwencyjne w próżni absolutnej w różnych warunkach i temperaturach. Nawet przy użyciu zaawansowanych metod, produktem końcowym są LIPOPROTEINY – cząsteczki tłuszczu o rozmiarach 1-50nm. Egzosomy stanowią jedynie około 0,5% całkowitego materiału pozyskanego z krwi.
Złożoność procesu
Uzyskanie w pełni wyizolowanych egzosomów wymaga użycia ultrawirówek, które pracują przy bardzo wysokich prędkościach (do 500 000 g). Standardowe wirówki laboratoryjne posiadają zakres jedynie do 2000 g (250x mniej) i dlatego niemożliwym jest, aby uzyskać za ich pomocą egzosomy. Próbki krwi ( 200-400ml) są poddawane sekwencyjnemu ultrawirowaniu, co jest procesem skomplikowanym, czasochłonnym i kosztownym.
Jeżeli w procesie uzyskano EV-like nanoparticles (cząsteczki egzosomopodobne, niebędące egzosomami), to i tak w składzie uzyskanego koncentratu w 99,5% były to lipoproteiny (1-50nm), czyli nanocząsteczki tłuszczu, które są mniejsze od egzosomów (30-200nm). Egzosomy z krwi lub osocza w pozyskanym materiale stanowiły zaledwie około 0,5% całości supernaturatu. Próba zmniejszenia ilości lipoprotein bezpośrednio wpłynęła na zmniejszenie się ilości egzosomów, co dowodzi, że na ten moment, nie da się odseparować od cząsteczek tłuszczu, aby uzyskać w pełni wyizolowane egzosomy.
Udowodniono, że na wirówkach niskoobrotowych nie na możliwości pozyskać w pełni wyizolowanych egzosomów – extracellular vesicles (EVs) – niskie obroty w rozumieniu badawczym to poniżej 70 000g. Warto zwrócić uwagę, że w czasie pozyskania iPRF wykorzystuje się wirowanie 55g, PRP 288g ( metoda lcc), a przy klasycznej “szybkiej” lub ,,twardej” metodzie pozyskania PRP wykorzystuje się parametry 1500g. Wirówki wykorzystywane w gabinetach medycyny estetycznej są w stanie osiągnąć maksymalnie siłę wynoszącą 2000g, gdzie szacuje się siła pozwalająca uzyskać egzosomy autologiczne wynosi aż 120 000g a wirowanie trwa wiele godzin (często są to wirowania całonocne).
Obok prezentujemy jeden z modeli ultrawirówki, wykorzystywany przez Uniwersytet Jagielloński w Krakowie do separacji nanocząsteczek i egzosomów w celu oznaczania markerów chorób (pozyskane egzosomo-podobne nanocząsteczki nie są podawane dawcy).
Badania i procedury izolacji
Badania opublikowane w International Immunology wykazały, że pełna izolacja tych pęcherzyków wymaga zaawansowanych technik ultrawirowania z powodu gęstości i lepkości osocza.
Izolacja egzosomów z płytek krwi (Plt-EV) została przeprowadzona na próbkach z Bonfils Blood Bank w Denver, Kolorado. Pacjenci zostali przebadani pod kątem infekcji bakteryjnej z negatywnymi wynikami. Proces obejmował kilkudniowe przechowywanie płytek krwi w temperaturze 22°C, delikatne kołysanie oraz wielokrotne wirowanie w różnych warunkach, z użyciem ultrawirówki Beckman Coulter Optima LE-80 K. Ostateczny osad zawieszono w PBS, zmierzono ilość białka za pomocą NanoDrop 2000, a następnie przechowywano próbki w -80°C.
Poniżej zaprezentowane potencjalne metody do prób pozyskania nanocząsteczek przypominających egzosomy z krwi. Metody i wytyczne zostały ogłoszone oficjalnie przez ISEV, jako potwierdzone do przeprowadzania badań w zakresie egzosomów:
Podsumowanie
Pozyskiwanie w pełni wyizolowanych egzosomów z krwi to skomplikowany i kosztowny proces, który obecnie nie daje zadowalających rezultatów oraz budzi kontrowersje. Metody izolacji wymagają dalszych badań, aby potwierdzić skuteczność i bezpieczeństwo terapii opartych na egzosomach autologicznych. Dostępne badania naukowe oraz naukowcy na chwilę obecną potwierdzają, że pozyskanie wyizolowanych egzosomów z krwi lub osocza w warunkach ambulatoryjnych u tego samego pacjenta jest niemożliwe.
Procedura ta jest niezgodna z aktualną wiedzą medyczną, nie ma żadnego uzasadnienia medycznego. Dlatego obietnica takiego zabiegu w ramach komercji ambulatoryjnej (podczas jednej wizyty pacjenta) może być traktowana jako nadużycie w zakresie etyki oraz wprowadzenia w błąd pacjenta.
[1] art. 160 Ustawy z dnia 6 czerwca 1997 roku Kodeks Karny (Dz.U.2024.17 t.j. z późn. zm.)
[1] art. 415 1 ustawy z dnia 23 kwietnia 1964 r. – Kodeks cywilny ( Dz.U.2023.1610 t.j. z późn. zm.)
[1] w szczególności naruszenia art. 2 Kodeksu Etyki Lekarskiej.
Edukacja i weryfikacja produktów na rynku medycyny estetycznej jest kluczowa, aby zapewnić ich bezpieczeństwo i skuteczność zabiegów.