Niezmiernie istotnym aspektem w zastosowaniu egzosomów jest jakość produktu. Ważne jest, by wytwarzać EV w procesie zgodnym z dobrą praktyką produkcyjną (GMP) i kontrolą jakości (QC) [40,41]. Odpowiednia kontrola ma również kluczowe znaczenie dla powtarzalności i porównywania wyników badań naukowych. International Society for Extracellular Vesicles (ISEV) zaproponowało standaryzację w tym zakresie, a jej zasady opublikowano jako Minimal Information for Studies of Extracellular Vesicles (MISEV) [42].
Z uwagi na fakt, że większość firm i laboratoriów zajmujących się wytwarzaniem tego typu preparatów znajduje się w Azji, Koreańskie Ministerstwo ds. Bezpieczeństwa Żywności i Leków (MFDS) opublikowało pierwsze na świecie wytyczne dotyczące produktów do terapii EV: „Wytyczne dotyczące jakości, nieklinicznej i klinicznej oceny produktów do terapii pęcherzykami pozakomórkowymi” [43]. Kryteria zawarte w tych wytycznych wchodzą w zakres GMP [43].
W odniesieniu do EV kryteria kontroli jakości obejmują określenie ilości, wielkości, pochodzenia i czystości EV. Kwantyfikację EV można osiągnąć, mierząc całkowitą ilość białek, lipidów i/lub RNA w produktach, ponieważ EV składają się z wymienionych substancji. Metody te nie dostarczają jednak informacji o liczbie cząstek EV. Natomiast dostępnych jest kilka metod pomiaru liczby i wielkości cząstek: analiza śledzenia nanocząstek (NTA), rezystancyjne wykrywanie impulsów (RPS) i dynamiczne rozpraszanie światła (DLS). Najpowszechniej stosowaną metodą jest jednak NTA [44,45], która pozwala określić liczbę i rozmiar cząstek poprzez śledzenie ruchów Browna cząstek w roztworze wodnym [46].
Techniki izolacji egzosomów na skalę przemysłową stale ewoluują, co ma na celu dostarczenie czystego i bezpiecznego preparatu, który nie spowoduje działań niepożądanych. Obecnie zaleca się metodę filtracji z przepływem stycznym (TFF) jako odpowiednią do izolowania egzosomów na skalę przemysłową [47]. Metoda TFF znacznie obniża stężenia mleczanu i amoniaku, które wpływają na toksyczność preparatu. Ostatnio opublikowane badania pokazały, że ludzkie egzosomy z ASC wyizolowane za pomocą technologii ExoSCRT™ (metoda izolacji egzosomów oparta na TFF) są bezpieczne i nie wykazują działań niepożądanych w testach toksykologicznych, w tym działania uczulającego na skórę, fotouczulającego in vitro ani podrażniającego oczy [48]. Produkt handlowy ASCE™ (znak towarowy ExoCoBio), czyli egzosomy ASC wyizolowane technologią ExoSCRT™, został po raz pierwszy zarejestrowany jako składnik kosmetyczny w International Cosmetic Ingredient Dictionary (ICID). Opublikowane wyniki badań pokazują, że egzosomy z ASC wyizolowane z użyciem TFF mają wieloraki wpływ na skórę:
1) indukują regenerację bariery naskórkowej poprzez zwiększenie syntezy ceramidów, dihydroceramidów, sfingozyny i S1P w skórze [68],
2) zmniejszają stan zapalny poprzez obniżenie stężenia cytokin prozapalnych [24],
3) zmniejszają poziom TSLP (cytokiny wywołującej świąd) [49],
4) indukują syntezę kolagenu i elastyny w HDF [50]. Ww. badania przeprowadzano na modelach zwierzęcych. Dla dalszej weryfikacji skuteczności terapii niezbędne są jednak wieloośrodkowe randomizowane badania, które udowodniłyby skuteczność egzosomów ASC w jednostkach chorobowych.
Większość opublikowanych badań podkreśla działanie immunomodulujące egzosomów z MSC. Cytokiny prozapalne, takie jak czynnik martwicy nowotworów (TNF-α), interleukina (IL-6 i IL-1β) są wytwarzane głównie przez aktywowane makrofagi i odgrywają ważną rolę w stymulacji odpowiedzi zapalnej, poprzez rekrutację dodatkowych komórek odpornościowych [51]. Z kolei cytokiny przeciwzapalne są wytwarzane przez regulatorowe limfocyty T (Treg), pomocnicze limfocyty T (Th2), alternatywnie aktywowane makrofagi i monocyty, które kontrolują reakcje zapalne i odporność [52,53]. Do głównych cytokin przeciwzapalnych należą: agonista receptora IL-1 (IL-1RA), IL-4, IL-10 oraz transformujący czynnik wzrostu (TGF-β) [76]. Cytokiny te hamują odpowiedź Th1 i produkcję cytokin prozapalnych [53].
Niekontrolowane przewlekłe reakcje zapalne leżą najczęściej u podłoża różnego typu chorób zapalnych, takich jak alergia, astma, choroby autoimmunologiczne, nieswoiste zapalenie jelit [54,55]. Ponadto obecnie wielu naukowców uważa zapalenie za pierwotną przyczynę takich chorób jak zawały serca, udary, cukrzyca typu 2, choroba Alzheimera, a nawet nowotwory [56]. Dlatego regulacja stanu zapalnego jest ważnym celem leczenia. Wykazano, że MSC mają zdolności immunosupresyjne i immunomodulujące, co wpływa na zmniejszenie stanu zapalnego i odpowiedzi immunologicznej [57]. Natomiast egzosomy z MSC mogą być doskonałą alternatywą dla terapii komórkowej MSC, ponieważ wykazują podobne właściwości biologiczne, lecz są przy tym bardziej stabilne i mają niższą immunogenność w porównaniu z komórkami macierzystymi [58]. W publikacjach poświęcono wiele miejsca na opisanie funkcji przeciwzapalnych i immunomodulujących egzosomów MSC. Istnieje coraz więcej dowodów, że promują one polaryzację makrofagów od M1 do M2. Makrofagi M1 charakteryzują się ekspresją cytokin prozapalnych: IL-1β, IL-12 i TNF-α, makrofagi M2 zaś są indukowane przez Th2, co prowadzi do wydzielania czynników przeciwzapalnych: IL-10 i TGF-β, oraz markerów M2, takich jak IL-1RA oraz CD163 [59]. Nie znamy jednak do końca mechanizmu komórkowego leżącego u podstaw regulacji polaryzacji makrofagów M2 przez egzosomy MSC.
Przeczytaj kolejną część artykułu, KLIKNIJ TUTAJ.
Dr n. med Lidia Majewska jest właścicielką krakowskiej kliniki medycyny estetycznej ESME Clinic. Posiada wieloletnie doświadczenie w praktyce zabiegowej oraz tworzeniu kompleksowych terapii estetycznych. Ukończyła Collegium Medicum Uniwersytetu Jagiellońskiego, Podyplomową Szkołę Medycyny Estetycznej Polskiego Towarzystwa Lekarskiego, a także studia podyplomowe z zakresu medycyny estetycznej w Krakowskiej Wyższej Szkole Promocji Zdrowia. Jest członkiem Polskiego Towarzystwa Medycyny Estetycznej i Anti-Aging oraz uczestnikiem International Master Course on Aging Skin.
Esme Clinic
Lwowska 1/16, 30-548 Kraków
Piśmiennictwo/References:
40. Gimona M., Pachler K., Laner-Plamberger S., Schallmoser K., Rohde E.: Manufacturing of human extracellular vesicle-based therapeutics for clinical use. Int J Mol Sci, 2017, 18: 1190.
41. Whitford W., Guterstam P.: Exosome manufacturing status. Future Med Chem, 2019, 11: 1225–1236.
42. Thery C., Witwer K.W., Aikawa E., Alcaraz M.J., Anderson J.D., Andriantsitohaina R. i in.: Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018), a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. J Extracell Vesicles, 2018, 7: 1535750.
43. Cell and Gene Therapy Products Division, Biopharmaceutical and Herbal Medicine Evaluation Department,National Institute of Food and Drug Safety Evaluation, Ministry of Food and Drug Safety. Guideline on Quality, Non-Clinical and Clinical Assessment of Extracellular Vesicles Therapy Product (dostęp 01/03/2023)
44. Bachurski D., Schuldner M., Nguyen P.H., Malz A., Reiners K.S., Grenzi P.C. i in.: Extracellular vesicle measurements with nanoparticle tracking analysis – An accuracy and repeatability comparison between NanoSight NS300 and ZetaView. J Extracell Vesicles, 2019, 8: 1596016.
45. Ramirez M., Amorim M.G., Gadelha C., Milic I., Welsh J.A., Freitas V.M., i in.: Technical challenges of working with extracellular vesicles. Nanoscale, 2018, 10: 881–906.
46. van der Pol E., Coumans F.A., Grootemaat A.E., Gardiner C., Sargent I.L., Harrison P. i in.: Particle size distribution of exosomes and microvesicles determined by transmission electron microscopy, flow cytometry,nanoparticle tracking analysis, and resistive pulse sensing. J Thromb Haemost, 2014, 12: 1182–1192.
47. Reiner A., Witwer K.W., van Balkom B.W.M., de Beer J., Brondie C., Corteling R.L. i in.: Concise review, developing best-practice models for the therapeutic use of extracellular vesicles. Stem Cells Transl Med, 2017, 6: 1730–1739.
48. Ha D.H., Kim S.D., Cho B.S., Lee J., Lee J.H., Park S.R. i in.: Toxicological evaluation of exosomes derived from human adipose tissue-derived mesenchymal stem/stromal cells. Regul Toxicol Pharmacol, 2020, 115: 104686.
49. Alzahrani F.A.: Melatonin improves therapeutic potential of mesenchymal stem cells-derived exosomes against renal ischemia-reperfusion injury in rats. Am J Transl Res, 2019, 11: 2887–2907.
50. Andriolo G., Provasi E., Lo Cicero V., Brambilla A., Soncin S., Torre T. i in.: Exosomes from human cardiac progenitor cells for therapeutic applications, development of a GMP-grade manufacturing method. Front Physiol, 2018, 9: 1169.
51. Zhang J.M., An J.: Cytokines, inflammation, and pain. Int Anesthesiol Clin, 2007, 45: 27–37.
52. Cicchese J.M., Evans S., Hult C., Joslyn L.R., Wessler T., Millar J.A. i in.: Dynamic balance of pro- and anti-inflammatory signals controls disease and limits pathology. Immunol Rev, 2018, 285: 147–167.
53. Opal S.M., DePalo V.A.: Anti-inflammatory cytokines. Chest, 2000, 117: 1162–1172.
54. Inflammatory Diseases. (dostęp 01/03/2023) www.nature.com/subjects/inflammatory-diseases
55. Sugimoto M.A., Sousa L.P., Pinho V., Perretti M., Teixeira M.M.: Resolution of inflammation, what controls itsonset? Front Immunol, 2016, 7: 160.
56. Hunter P.: The inflammation theory of disease. The growing realization that chronic inflammation is crucial in many diseases opens new avenues for treatment. EMBO Rep, 2012, 13: 968–970.
57. Chang C.L., Sung P.H., Chen K.H., Shao P.L., Yang C.C., Cheng B.C. i in.: Adipose-derived mesenchymal stem cell-derived exosomes alleviate overwhelming systemic inflammatory reaction and organ damage and improve outcome in rat sepsis syndrome. Am J Transl Res, 2018, 10: 1053–1070.
58. Yu B., Zhang X., Li X.: Exosomes derived from mesenchymal stem cells. Int J Mol Sci, 2014, 15: 4142–4157.
59. Murray P.J.: Macrophage polarization. Annu Rev Physiol, 2017, 79: 541–566.